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毛细管电泳电导法快速检测复方维生素B片中的VB1
来源:中国仪器仪表大市场信息中心    时间:2008/7/24  浏览数:2981  【我要关闭



摘 要:采用高效毛细管电泳电导法同时分离、测定了复方维生素B片中的主要成分VB1,VBl2,VB6和VC的含量。研究了运行缓冲溶液的酸度和浓度、电泳电压、进样时间等因素对电泳的影响。在优化的实验条件下:40 mmolL Tris-4mmolL H3BO3(pH 8.0)的缓冲溶液中加入0.30 mmolL CTAB(溴化十六烷基三甲基铵),分离电压为15kV,上述4组分在5 min内得到良好的分离。维生素B1,B12,B6和VC的线性范围分别为5.5~1.0mgmL;15~1.5 mgmL;1.0~0.40mgmL和6.6~0.80mgmL;检测限分别为0.80μgmL,4.0μgmL,0.50μgmL,2.9μgmL;5次测定峰高的相对标准偏差分别为2.2%,1.6%,3.9%,2.8%。 5次测定的平均回收率分别为99%,94%,100%,97%。

  关键词:高效毛细管电泳;电导检测;复方维生素B片
VB1,VBl2,VB6和VC都是水溶性的维生素,是维持人体正常代谢功能所必需的生物活性物质。这些药物的分析多是采用分光光度法[1,2],荧光法[3,4],高效液相色谱法[5]。分光光度法和荧光法因干扰因素多,谱峰相互重叠而无法同时测定多种维生素,常常需要多种方法相互配合才能完成,不利于快速分析;高效液相色谱也因仪器昂贵,运行成本高,分析时间长而受到限制。高效毛细管电泳(HPCE)在药物和临床研究领域已成为不可缺少的有力手段,已用于几百种药物及各种剂型中主要成分的分析。应用HPCE伏安法分离测定药物中VC[6]或维生素B[7]已有报道,但未见有采用电导法同时测定复方维生素B片中主要成分VB1,VBl2,VB6和VC报道。本文采用高效毛细管电泳电导检测法在5min内快速分离、同时测定复方维生素B片中主要成分VBl,VBl2,VB6和VC。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂
  毛细管电泳仪为中山大学分析组自组装,包括CZE30PNl0MCNZ2型高压电源(美国High Voltage Electronics Corp.),石英毛细管柱50cm×75μm(河北永年光导纤维厂),KL-138型电导率仪(科立龙电子有限公司),毛细管电泳数据工作站(CES98中山大学化学系),毛细管电泳仪装置见文献[8]。KL-013精密酸度计(科立龙电子有限公司)。三羟甲基氨基甲烷(Tris,上海试剂三厂,分析纯);十六烷基三(甲基)溴化铵(CTAB,广州化学试剂厂,分析纯);硼酸(AR);复方维生素B片(湖南省制药有限公司产品,批号:000702),VBl,VBl2,VB6和VC均为生化试剂,VC和其它试剂均为分析纯,水为二次去离子水。
1.2 溶液配制
  分别配制100 mmolL CTAB和同浓度的Tris、H3B03储备液,各取适量制备不同浓度不同pH值的缓冲液。VB1,VBl2,VB6和VC标准储备液(1.0mgL):每次实验前用二次去离子水新鲜配制。进样用的VB1,VBl2,VB6和VC标准溶液用所运行的缓冲液稀释成30.0μgmL。
1.3 实验方法
  联接好毛细管电泳仪和检测装置。毛细管在使用前依次用0.1 molL NaOH,二次重蒸水和缓冲液各冲洗5 min;Pt丝检测电极在使用前用超声波清洗,更换缓冲液或每进样4次后需按上述步骤清洗毛细管和电极;采用重力进样方式,进样高度20cm,进样时间5s,操作电压15kV,电导率仪检测的输出信号经数据工作站采集到微机中进行实时数据处理,图形显示和数据文件存储。实验在恒温(25℃),恒湿(相对湿度65%)的实验条件下进行。
2 结果讨论
2.1 缓冲溶液的选择
  缓冲溶液的选择直接影响离子的迁移和分离。为了使维生素在运行缓冲溶液中离解为离子状态,考察了NH4CI-NH3(pH9.0);Na2HPO4-NaH2PO4(pH9.0);Na2B4O7-H3BO3(pH9.0);Tris-柠檬酸Cit(pH9.0);Tris-H3BO3(pH 9.0)5种缓冲溶液体系对分离的影响。结果发现在前3种缓冲体系中维生素峰出峰不全,而且体系由于离子强度大,产生较大的焦耳热导致维生素各峰形均有不同程度展宽。在后2种体系中,分离效果好一些,但VC峰和VB6峰形有部分重叠。本文选择Tris-H3BO3为运行缓冲溶液。
2.2 缓冲液酸度和浓度的影响
  考察了Tris-H3BO3缓冲液中不同的pH值(pH7~10)对分离的影响。实验发现随溶液pH升高,由于电渗流加快,导致VC峰和VB6峰重叠的程度加剧,分离度变差;而在低pH,VBl2和VB6峰有拖尾。可能是毛细管管壁对样品产生吸附的缘故。其中以pH 8.0时分离效果较好。为了考察缓冲溶液浓度对分离的影响,配制了10 mmolL Tris-1mmolL H3BO3;20 mmolL Tris-2 mmolL H3BO3;30 mmolL Tris-3 mmolL H3BO3;40 mmolL Tris-4mmolL H3BO3;50 mmolL Tris-5 mmolL H3BO3;60mmolL Tris-6 mmolL H3BO3的缓冲溶液(pH 8.0)。实验结果发现:随缓冲溶液浓度升高,维生素各峰之间的分离度增大,迁移时间增加,峰的拖尾现象得到改善。我们认为随着溶液浓度增大,离子强度增加,从而改变了缓冲溶液的容量,减少溶质和管壁之间的相互作用。但焦耳热增加,基线不稳,峰形展宽。为了兼顾分离度、峰形和分析速度,选择40 mmolL Tris-4 mmolL H3BO3(pH 8.0)为运行缓冲液。
2.3 有机溶剂的影响
  为了进一步消除管壁对样品的吸附,从而消除峰的拖尾现象,我们在运行缓冲溶液中加入少量CTAB。发现CTAB对体系的分离影响很大。当加入CTAB的量从0.1~0.5 mmolL之间变化,随着CTAB量增加,出峰时间延长,峰形变好,分离度增加,灵敏度提高。但当CTAB量大于或等于0.50 mmolL时,灵敏度下降,出峰时间大大推后。为得到高的灵敏度,缩短分析时间,故选择CTAB的浓度为0.30 mmolL。
2.4 进样时间的影响
  考察进样时间在2~20s对峰高和分离度的影响。发现随进样时间增加,峰高或峰面积增加。当进样时间达12s后,峰形展宽且部分重叠,导致分离度下降。因此选择最佳进样时间10s。
2.5 分离电压的影响
  试验了分离电压6~30kV对迁移时间和分离度的影响。在选定的实验条件下,加6kV分离电,20min内无峰出现;随着电压增加,出峰时间迅速提前。当分离电压大于15 kV时,焦耳热明显增加,从而使柱效和分离度下降,因此选择分离电压为15kV。

电泳条件:40 mmolL Tris+4 mmolL H3B03+0.3 mmolL CTAB(pH 8.0);工作电压:15kV;进样时间:10s;进样高度:20cm;1-VBl2;2-VB1;3-VC;4-VB6测得的模拟样品的维生素混合标准溶液和复方维生素B片样液的电泳图。
2.6 线性实验及重现性
  在上述优化条件下,将混合标准溶液连续进样5次,VBl,VBl2,VB6和VC峰高的相对标准偏差RSD分别为2.2%,1.6%,3.9%,2.8%。迁移时间的RSD分别为0.65%,0.43%,1.3%,0.78%。为提高总体分析速度,采用外标法定量。配制一系列不同浓度的维生素VB1,VBl2,VB6和VC的混合标准溶液,在选定的实验条件下测定峰高。维生素VBl,VBl2,VB6和VC的峰高(y)和质量浓度x(μ.gmL)分别在5.5∽1.0 mgmL,15~1.5mgmL,1.0∽0.40mgmL,6.6~0.80mgmL范围内呈良好的线性关系。检测限(SN=3)分别为1.8,4.0,0.50,2.9μgmL。线性回归方程分别为y=5.83x+10.24(y=0.988);y=8.44x+17.56(y=0.990);y=3.28x+12.36(y=0.983);y=6.20x+22.71(y=0.994)。
2.7 样品分析
  将复方维生素B片用研钵研成粉末,准确称取相当于1片片剂质量的粉末,用运行缓冲溶液溶解,定容于50mL容量瓶中,在选定的实验条件下,直接进样。样品分离电泳图见图10加入一定量VB1,VB6,VBl2和VC标准样品,进行加标回收实验,5次测定结果的平均回收率,相对标准偏差见表1。
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